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上海遠(yuǎn)慕分析蛋白純化方法及其優(yōu)缺點(diǎn)
點(diǎn)擊次數(shù):1040 更新時(shí)間:2016-11-14

 

    分析蛋白純化方法及其優(yōu)缺點(diǎn)


    1.蛋白沉淀蛋白能溶于水是因?yàn)槠浔砻嬗杏H水性氨基酸,在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強(qiáng)度特別高或者特別低,蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白zui常用的鹽,因?yàn)樗诶涞木彌_液中溶解性好,冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。


    2.緩沖液的更換雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度,但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來(lái),毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中,需要想辦法脫鹽,可用的方法有利用半透膜透析,通過(guò)勤換透析液體去除鹽分,此法尚可,但需幾個(gè)小時(shí),通常要過(guò)夜,也難以用予大規(guī)模純化中。


    3.離子交換色譜這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法。基于蛋白與離子交換樹脂間的相互電荷作用,通過(guò)選擇不同的緩沖液,同一種蛋白既可以和陰離子交換樹脂(能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子)結(jié)合,也可以和陽(yáng)離子交換樹脂結(jié)合。樹脂所用的帶電基團(tuán)有四種:二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹脂;羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹脂;季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹脂;甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成,氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。


    4.親和層析親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留,其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是:?jiǎn)慰狗浅0嘿F,而且也需先純化;單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來(lái)洗脫,這會(huì)使目的蛋白失活并破壞單抗;混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合;


    5.疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結(jié)構(gòu)的中心部位,遠(yuǎn)離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子,所以通常情況下整個(gè)蛋白分子被水分子包圍著,疏水性氨基酸不會(huì)暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會(huì)暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結(jié)合。不同的蛋白疏水性不同,與疏水作用力大小也不同,通過(guò)逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子,在鹽濃度很低時(shí),蛋白恢復(fù)自然狀態(tài),疏水作用力減弱被洗脫出來(lái)。


    6.排阻層析也叫凝膠過(guò)濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì),柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動(dòng)相,也稱無(wú)效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內(nèi),只能存在于無(wú)效體積的溶液中,將會(huì)zui早從柱中洗脫出來(lái),對(duì)這部分蛋白無(wú)純化效果。

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