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細胞凋亡 WB 沒成功,你是不是用了 RIPA?
點擊次數(shù):1323 更新時間:2018-09-05

      細胞凋亡是一種在基因控制下的細胞主動死亡過程,通常表現(xiàn)為核濃縮,起皺,膜發(fā)泡以及 DNA pian段化。WB 是研究細胞凋亡機理的基本方法之一,但是 WB 也不是誰都能做成功的,因為有可能你的步就做錯了!用 WB 做細胞凋亡研究樣品制備是步,樣品制備方法至關重要否則會得到錯誤的結果和結論。

樣品制備,看你是不是這樣做的:

自配裂解液或者購買 RIPA,加上樣品研磨啊研磨,孵育啊孵育,然后離心扔掉沉淀(RIPA 不可溶組分),取上清(RIPA 可溶組分)進行下游實驗。

對對對!都是這么做啊,扔了取上清!

且慢,我們扔掉了,扔掉了,扔掉了一些啥?要不要緊,影響細胞凋亡的實驗結果不?

例一. Zapata et al., (1998). Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.

 

Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中 caspase-3 為關鍵的執(zhí)行分子,它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的 Caspase-3 由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成,裂解相應的胞漿胞核底物,終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞,caspase 的活性明顯下降。

? 研究方法

1. 分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細胞(Lanes 1 和 5)和激活的 T 淋巴細胞(Lanes 2-4 和 6-8)裂解細胞提取總蛋白

2. WB 進行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 檢測

? 主要發(fā)現(xiàn)

p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中,但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。

例二.Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.

 

? 研究方法

1. MCF10A-5E 人ru腺上皮細胞激活 Fas 死亡受體,無激活組為對照

2. 分別用 NP-40(不含 SDS 和脫氧膽酸鹽),RIPA buffer, Laemmil(SB)樣品緩沖液提取蛋白

3. WB 進行 Clv-caspase-8 檢測, Hsp90,Tubulin,P38 作為對照

? 主要發(fā)現(xiàn)

結果顯示,僅在 Laemmil 緩沖液提取的樣品中檢測到激活形式的 Caspase-8,而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白樣品中均未檢測到。證明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜,某些特定蛋白會因刺激方式在可溶性和不可溶性組分之間移動。

例三.CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010

 

? 研究方法

1. MDA-MB231 細胞,分別用 shCon,shSnail 質粒轉染,分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基及 GD 培養(yǎng)基 12 小時

2. 使用 RIPA 提取蛋白,分別將 RIPA 可溶性組分和 RIPA 不可溶性組分進行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1,WB 檢測。

? 主要發(fā)現(xiàn)

某些特定刺激誘導凋亡后,P53,caspase3,caspase9 等會聚集在 RIPA 不可溶組分中,不可溶性組分中 P53 和 caspase 9 信號甚至比可溶性組分中更強,表明目標蛋白在 RIPA 不可溶組分中顯著丟失。證明 RIPA 并不能提取到真正意義上的總蛋白,丟掉的不可溶組分中還有很多蛋白,甚至是目標蛋白。

例四 .SU YEON LEE,et al(2010).Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010

 

? 研究方法

1. MCF-7 細胞培養(yǎng) 4-9 天后,用 RIPA 分別進行蛋白提取,分為 RIPA 可溶性組分和不可溶性組分兩組

2. SDS-PAGE 后,立春紅染色(圖 A),用 WB 分別檢測 p53,CuZnSOD,MnSOD,Tubulin(圖 B)

? 主要發(fā)現(xiàn)

MTS 培養(yǎng)過程中,RIPA 不可溶性組分中蛋白增加,可溶性組分和不可溶性組分蛋白圖譜有很大差異,胞漿中的 CuZnSOD 和線粒體中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性組分中,而 p53 和 tubulin 則在 RIPA 可溶性和不可溶性組分中都存在。這表明,如果僅使用可溶性組分研究目標蛋白的定量,則結論可能是不準確或出現(xiàn)偏頗。

看了一圈下來,細胞凋亡 WB 沒成功的原因,很可能就是因為你用了 RIPA!

RIPA 不適合做細胞凋亡 WB 檢測的原因

1. RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 and caspase-7。

2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜,目標蛋白及內參蛋白常常會丟失在被丟棄的不可溶組分中,僅使用可溶性組分研究不嚴謹。

3. RIPA buffer 提取的蛋白圖譜偏差會得出錯誤或偏差結論,特別是涉及目標蛋白的定量問題時。

 

 

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