穩(wěn)轉株是指通過基因工程手段獲得穩(wěn)定過表達或抑制特定基因的細胞株。一般將目的基因序列或抑制目的基因的shRNA序列裝載至重組載體中，再通過慢病毒系統或轉座子系統將目的序列整合至宿主細胞的染色體中，實現目的基因持續(xù)、穩(wěn)定的調控。

通過慢病毒系統或轉座子系統轉染并經過藥物篩選獲得的陽性細胞是一個混合細胞池，即多克隆細胞系。單克隆細胞系則是從多克隆細胞系中分選得到的，由單一細胞擴增得到的細胞株。穩(wěn)轉株細胞系是科研工作者常用的基因調控細胞模型，常規(guī)的科研實驗，多克隆細胞系是可以滿足需求的，但某些應用場景需要穩(wěn)轉株單克隆化。今天與大家一起回顧穩(wěn)轉株與其單克隆化的應用要點。

一、什么時候需要構建穩(wěn)轉株呢？

長期在目的細胞中研究基因的功能

部分蛋白半衰期極長，瞬時RNA只能干擾表達，無法去除已經表達的目的蛋白，想要實現更好的基因干擾效果

需要用誘導表達系統的，主要是一些致死基因或者是需要時空表達的

需要用細胞做動物實驗的，比如裸鼠成瘤等

需要進行藥物篩選、構建重組蛋白、生產制備抗體和報告細胞系等也需要構建穩(wěn)轉株

二、單克隆化的優(yōu)點與必要性

藥物篩選獲得的多克隆細胞系由單克隆細胞株組成的。由于慢病毒整合位點與拷貝數的不確定性導致各個單克隆基因組存在異質性，使每個單克隆的目的基因表達水平和細胞表型也不相同。不經過單克隆化而繼續(xù)傳代培養(yǎng)，由于各單克隆的生長速度不一致（目的基因表達較低的克隆增殖速度較快），會存在生長優(yōu)勢抑制的問題，傳代多次以后高表達目的基因的單克隆會逐漸消失，出現多克隆穩(wěn)轉株因多次傳代而表達量逐漸下降的現象。因此，單克隆化可以提高穩(wěn)轉株基因組的均一性和表型的穩(wěn)定性。

一般情況下，多克隆穩(wěn)轉株是可以滿足我們的科研需求的，比如初步驗證基因功能，其優(yōu)點是節(jié)省了單克隆化的時間與經濟成本。但得出的數據穩(wěn)定性與重復性往往欠佳，如果想減少實驗的波動，提高實驗的可重復性，展現更加嚴謹的實驗數據，則需要單克隆化。此外，用于工業(yè)生產的穩(wěn)轉株一般都需要進行單克隆化。工業(yè)生產中需要保證生產工藝和質量穩(wěn)定可控，因此需要通過單克隆化將細胞庫的異質性降至最/低。此外，還有一些特殊的情況需要單克隆化。比如由于不同細胞系與目的基因自身生物學的特性，會存在轉染效率低、表達效率過低或過高，構建得到的多克隆穩(wěn)轉株中只有個別克隆的符合表達需求，此時則需要進行單克隆化分選合適的細胞系。

三、單克隆化的方法

單細胞分離方法中，常見的有限稀釋法（limiting dilution cloning, LDC）和流式細胞術分選法等。此外，克隆篩選單細胞打印系統、ClonePix高通量細胞克隆篩選系統和細胞成像技術等新技術也逐漸用于細胞單克隆化或確認單克隆性，有效提高篩選的效率和精度。

★有限稀釋法：

該方法是將混合細胞池以一定梯度進行稀釋，再以0.5cell/孔或以下的要求進行鋪板。該方法是現今最/常用的，具有操作簡單、對設備要求較低等優(yōu)點。但依賴人工操作，耗時久、效率低、花費大量的96或384孔板等缺點也需要關注。并且篩選得到的克隆只是基于稀釋比例得到的理論單克隆，難以確定所選細胞是單克隆。該方法通過結合成像系統技術，記錄每個單孔中的克隆初始狀態(tài)和生長情況，則可以提高有限稀釋法的精度。

★流式細胞熒光分選技術：

依據細胞的大小、細胞內含物復雜程度、細胞內所含的熒光染料、細胞表面膜蛋白等參數，可以通過流式細胞儀從多克隆細胞池中分選出單克隆。一般可以分選下列兩種情況的細胞，一是在慢病毒載體中插入了熒光標記，轉染后細胞內表達熒光蛋白，并通過其進行分選。第二種是過表達某種蛋白于細胞膜表面，此時用帶有熒光標記的抗體進行孵育，再通過流式進行分選。使用流式細胞儀分選單細胞，單克隆形成率高，并且可以與單克隆成像系統連用，確定單克隆。

四、總結

穩(wěn)轉株是研究基因功能和生物醫(yī)藥生產應用的重要細胞工具，且穩(wěn)轉株單克隆化可有效提高細胞系的均一性。我們可以根據實際需求，考慮是否單克隆化。