微生物侵入法，又稱(chēng)微生物挑戰(zhàn)法，是一種較為常見(jiàn)的密封完整性測(cè)試方法，通常與模擬灌裝同時(shí)進(jìn)行。通過(guò)按照模擬灌裝驗(yàn)證方案進(jìn)行培養(yǎng)基模擬灌裝，然后進(jìn)行壓塞軋蓋后，目檢合格，經(jīng)已驗(yàn)證的滅菌柜滅菌后，將容器密封面浸入到高濃度的菌液中，使樣品容器內(nèi)的培養(yǎng)基充分接觸封口內(nèi)表面，樣品的頸部及封口的外表面應(yīng)完/全浸泡在菌懸液中，浸泡一定時(shí)間后取出，定期培養(yǎng)后檢查是否有微生物侵入，以確定容器密封系統(tǒng)的完整性。同時(shí)，需要做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，確認(rèn)培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力。

一、微生物侵入法試驗(yàn)方法

將新鮮的銅綠假單胞菌（Pswudomonas aeruginosa）ATCC9027的菌懸液倒入不銹鋼桶中。

1、將50個(gè)經(jīng)滅菌的試樣編號(hào)，完/全侵入菌懸液中，同時(shí)將袋平放，使袋內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)基充分接觸焊接部位的內(nèi)表面，試樣容器在菌懸液中持續(xù)浸泡4小時(shí)。

2、浸泡結(jié)束時(shí)再取一份菌懸液，用平板計(jì)數(shù)菌懸液的濃度。

3、從菌懸液中取出試樣，擦干試樣容器外殘余的菌懸液，然后用含0.5%過(guò)乙酸的70%異丙醇消毒容器外表面。

4、取裝滿培養(yǎng)基樣品兩個(gè)，作陽(yáng)性對(duì)照，其外表用含0.5%過(guò)乙酸的70%異丙醇消毒，接種入10～100CFU銅綠假單胞菌，按步驟8.2進(jìn)行培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)。

5、將挑戰(zhàn)試驗(yàn)用的試樣培養(yǎng)7天，觀察檢查試樣容器內(nèi)培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)情況。有生長(zhǎng)記作+，無(wú)生長(zhǎng)記作-。如果試樣容器長(zhǎng)菌，按8.2方法確認(rèn)生長(zhǎng)菌是挑戰(zhàn)微生物——銅綠假單胞菌；如果所有試樣容器都不長(zhǎng)菌，則取10個(gè)試樣按8.2進(jìn)行培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)。

6、試驗(yàn)結(jié)束后，挑戰(zhàn)試驗(yàn)用菌懸液經(jīng)121℃30分鐘滅菌后丟棄。

二、微生物侵入法判斷標(biāo)準(zhǔn)

1、步驟2、步驟4、5中進(jìn)行的營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)都合格，試樣的挑戰(zhàn)試驗(yàn)才有效。

2、在挑戰(zhàn)試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，挑戰(zhàn)用菌懸液濃度（活菌數(shù)）必須達(dá)到1×106CFU/ml。

3、挑戰(zhàn)試驗(yàn)中如長(zhǎng)菌，需記錄長(zhǎng)菌的試樣數(shù)，并按下述要求作進(jìn)一步調(diào)查。

4、仔細(xì)檢查容器各部位封口處是否有缺損，造成微生物浸入。

5、將觀察到試樣容器封口的缺陷，采用拍照詳細(xì)記錄。

6、如果任何挑戰(zhàn)試驗(yàn)中長(zhǎng)菌的容器不是由于容器封口明顯的物理性缺損所致，試驗(yàn)作失敗論處。