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遠(yuǎn)慕分享PCR緩沖液的相關(guān)介紹
點(diǎn)擊次數(shù):474 更新時(shí)間:2022-12-27

用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見PCR操作范例。于72℃時(shí),反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)單位,接近于7.2。二價(jià)陽離子的存在至關(guān)重要,影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)表明,Mg2 優(yōu)于Mn2 ,而Ca2 無任何作用。

1.Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時(shí)),但并非對(duì)任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。shou次使用靶序列和引物結(jié)合時(shí),都要把Mg2 濃度調(diào)到最佳,其濃度變化范圍為1~10mmol/L。Mg2 過量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,Mg2 不足易使產(chǎn)量降低。

樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)如磷酸根,會(huì)與Mg2 結(jié)合而降低Mg2 有效濃度。因此,用作模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

dNTP含有磷酸根,其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此,在高濃度DNA及dNTP條件時(shí),必須相應(yīng)調(diào)整Mg2 的濃度。

2.Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris –HCl緩沖液,很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液,pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此,20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時(shí),在典型的熱循環(huán)條件下,真正的pH值在7.8~6.8之間。

3.KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時(shí)能促進(jìn)引物退火。但研究表明,NaCl濃度在50mmol/L時(shí),KCl濃度高于50mmol/L將會(huì)抑制Taq酶的活性,少加或不加KCl對(duì)PCR結(jié)果沒有太大影響。

4.明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100μg/ml,但現(xiàn)在的研究表明,加或不加都能得到良好和PCR結(jié)果,影響不大。

5.二甲基亞砜(DMSO)在使用Klenow片段進(jìn)行PCR時(shí)DMSO是有用的;加入10%DM-SO有利于減少DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),使(G C)%含量高的模板易于wan全變性,在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測(cè)序更易進(jìn)行,但超過10%時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性,因此,大多數(shù)并不使用DMSO。

PCR中Ph緩沖液的作用

第一,PCR緩沖液就是給PCR反應(yīng)提供的一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。

第二,例如緩沖液中的鎂離子在酶催化過程中,結(jié)合到酶-底物結(jié)合體上,從而使催化反應(yīng)的活化能更加降低。使得反應(yīng)能夠進(jìn)行。

第三,PH緩沖液是保證PCR反應(yīng)正常進(jìn)行的關(guān)鍵條件之一。

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