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質(zhì)粒DNA的酶切原理和操作步驟
點(diǎn)擊次數(shù):395 更新時(shí)間:2023-01-06

1.目的


學(xué)會(huì)用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。


2.原理


II型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷,形成粘性末端或齊平末端,通過(guò)電泳酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。


3.器材


旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml微量離心管,雙面微量離心管架,水漂,恒溫水浴。


4.試劑


Pinpoint?xa-3質(zhì)粒,EcoR V,BamH I,內(nèi)切酶緩沖液(10×),10×電泳加樣緩沖液,熒光染料。


5.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備


配制TAE電泳緩沖液(50?儲(chǔ)存液),10?加樣緩沖液,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)。


6.操作步驟


(1)混合下列溶液于一個(gè)無(wú)菌的1.5ml微量離心管中:


Pinpoint?xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl


10×酶切緩沖液(用EcoRV的緩沖液) 2 μl


ddH2O 30 μl


EcoRV 1μl


BamHI 1μl


總體積 40μl


(2)先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。從-20℃冰柜中取出限制性內(nèi)切酶,立即插入冰塊中。


(3)用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部(以免手指的給酶液加溫),另一只手持微量移液器,小心翼翼地吸取1 μl限制性內(nèi)切酶。


(4)在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后(立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜!),輕輕震動(dòng)微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中,在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1~3 h(一般是 37℃)。


(5)酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA(如先前的PCR產(chǎn)物)對(duì)比電泳,以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。


(6)酶切后的質(zhì)粒可以回收備用(見實(shí)驗(yàn)六:從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段)。


(7)清理桌面垃圾,清洗實(shí)驗(yàn)儀器。撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。


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