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細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)和樣本制備操作
點(diǎn)擊次數(shù):375 更新時(shí)間:2023-02-20

一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解,具體方法如下:

試劑與設(shè)備
(1)表達(dá)待檢測(cè)蛋白質(zhì)的細(xì)菌。
(2)50mmoL/LTris-HCl(pH7.4)。
(3)2xSDS凝膠加樣緩沖液:
100mmol/L Tris—HCl(pH6.8)
200mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)
4% SDS(電泳級(jí))
0.2% 溴酚藍(lán)
20% 甘油
不含有二硫蘇糖醇(DTT)的2XSDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫,臨用前須從1mol/L二硫蘇糖醇儲(chǔ)存液現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。
(4)臺(tái)式離心機(jī)。
(5)超聲破碎儀。
(6)水浴箱。
(7)渦漩振蕩器。
(8)加樣器與吸頭等。

操作步驟
(1)表達(dá)靶蛋白大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后,用微量離心機(jī)以12 000g離心30s,收集1ml培養(yǎng)的菌體。
(2)吸取培養(yǎng)液,加入0.5ml用冰預(yù)冷的50mmol/LTris—HCl(pH7.4),振蕩沉淀的菌體,使之復(fù)懸,用微量離心機(jī)于0°C以12000g離心30s回收菌體。
(3)再次吸出上清液,小心地吸凈管壁上的液滴,盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。
(4)加入25μl水,振蕩使沉淀復(fù)懸,一旦菌體分散開來(lái),立即加入25μl 2XSDS凝膠加樣緩沖液,繼續(xù)振蕩20s。
(5)樣品在沸水浴中放置5min。
(6)采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時(shí)處理多個(gè)樣品的超聲處理儀對(duì)DNA進(jìn)行剪切,根據(jù)所用超聲處理儀的輸出功率及其設(shè)定狀態(tài),以最大功率處理0.5—2min應(yīng)能有效地將裂解液粘度降至可控水平;
(7)樣品于室溫以12000g離心10min,將上清液移至另一管中,棄沉淀物;
(8)吸取經(jīng)剪切或超聲處理的樣品25μl電泳,剩余樣品保存于—20℃?zhèn)溆谩?/p>

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