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遠(yuǎn)慕簡(jiǎn)述巨噬細(xì)胞的分離和純化
點(diǎn)擊次數(shù):434 更新時(shí)間:2023-04-10

  1、取2~3公斤重的家兔,耳緣靜脈注射10ml空氣處死動(dòng)物或注射2ml(含130mg)戊巴bi妥麻醉動(dòng)物。仰臥固定,消毒胸部,剪開(kāi)胸壁。以下過(guò)程注意無(wú)菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管,分離心臟和血管,取出肺,剪去脂肪和結(jié)締組織。用無(wú)菌紗布小心擦凈肺表面,稱重。

  2、分離肺泡巨噬細(xì)胞:用夾子夾住氣管,使肺懸空。向氣管中注射40ml無(wú)菌的冷生理鹽水,讓生理鹽水進(jìn)入全部肺泡。用鑷子提起氣管,從夾子下面剪斷氣管,將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法,用40ml無(wú)菌冷生理鹽水沖洗肺泡,合并浸出液,置4℃。

  3、分離肺組織中的巨噬細(xì)胞:取出肺泡巨噬細(xì)胞后,剪去氣管,將肺組織放在有冷RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上,用吸滿冷RPMI-1640培養(yǎng)液的20ml注射器接23號(hào)針頭,一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織,直到肺組織與支氣管樹(shù)全部分離。使肺組織通過(guò)00目的鋼絲網(wǎng),分離單細(xì)胞。

  4、以下過(guò)程均在4℃中進(jìn)行。分別處移動(dòng)圖片理肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織中的巨噬細(xì)胞:離心200×g10分鐘,去上清液。輕彈試管,懸浮細(xì)胞,加入10ml低滲液(20mmol/LTris,0.75%氯化銨,pH7.4),37℃處理3~5分鐘,溶解紅細(xì)胞。紅細(xì)胞通常分別占肺泡巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的1%和10%。也可以不用低滲處理,直接在淋巴細(xì)胞分離液上分離巨噬細(xì)胞。

  5、離心200×g10分鐘,去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次。將細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)上,離心400×g20分鐘,收集交界面的巨噬細(xì)胞。棄去沉淀的死細(xì)胞和紅細(xì)胞。

  6、用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌巨噬細(xì)胞2次。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù),將細(xì)胞配成所需濃度。此時(shí)巨噬細(xì)胞活力可達(dá)90%以上,巨噬細(xì)胞占全部細(xì)胞的90%以上。

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