目前中國(guó)藥典、消毒技術(shù)規(guī)范中用于各種化學(xué)消毒劑、干熱、環(huán)氧乙烷、高壓蒸汽等滅菌效果的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)的芽胞懸液的獲得主要通過(guò)自制和商品化兩種途徑。

一、自制芽胞懸液

(1) 菌種處理：取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開(kāi)，以毛細(xì)吸管吸加適量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5～10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，即為第3代培養(yǎng)物。

(2) 轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基：用10.0ml吸管吸取5.0～10.0ml第3～5代的18～24小時(shí)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將羅氏瓶置于37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)5～7天。

(3) 觀察芽胞形成：用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在顯微鏡(油鏡)下進(jìn)行鏡檢。當(dāng)芽胞形成率達(dá)95％以上時(shí)，即可進(jìn)行以下處理。否則，應(yīng)繼續(xù)在室溫下放置一定時(shí)間，直至達(dá)到上述芽胞形成率后再進(jìn)行以下處理。

改良芽胞染色法：

①用接種環(huán)取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而后通過(guò)火焰加熱將菌固定于玻片上。

②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0％孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放54℃～56℃條件下，加熱30分鐘。取出。去濾紙，用自來(lái)水沖洗殘留孔雀綠溶液。

③加0.5％沙黃水溶液，染1分鐘。水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。

(4) 制成芽胞懸液：羅氏瓶培養(yǎng)物，用10.0ml吸管加10.0ml無(wú)菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第1批洗下的菌懸液，再向瓶?jī)?nèi)吸加5.0ml無(wú)菌蒸餾水，重復(fù)洗菌一遍。將第1和第2批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無(wú)菌三角燒瓶中，振搖5分鐘，打碎菌塊，使成均勻的芽胞懸液。（注意：必要時(shí)，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置45℃水浴中24小時(shí)，使菌自溶斷鏈。分散成單個(gè)芽胞。）

(5)純化芽胞液：用無(wú)菌棉花或紗布過(guò)濾芽胞懸液，清除其中的瓊脂凝塊。將過(guò)濾后的芽胞懸液，置無(wú)菌離心管內(nèi)，以3000轉(zhuǎn)／分速度離心30分鐘。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共3遍。將洗凈的芽胞懸浮于三角燒瓶?jī)?nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。將芽胞液放于80℃水浴中10分鐘(或60℃，30分鐘)，以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。有效使用期為半年。

(6)芽胞懸液在使用時(shí)，應(yīng)用平板法先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。懷疑有雜菌污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。

二、商品化芽胞懸液

HKM™定量芽胞懸液（菌種名稱：wei縮芽孢桿菌（曾用名：枯草芽孢桿菌黑色變種）ATCC9372）

產(chǎn)品介紹：該芽胞懸液是根據(jù)國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC9372，參照國(guó)家藥典、消毒技術(shù)規(guī)范、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)等，經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)量控制制備而成。該菌株懸液含有一定數(shù)量的芽胞，用于自制生物指示劑應(yīng)用于各種化學(xué)消毒劑、干熱、環(huán)氧乙烷等滅菌效果的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，無(wú)菌冷灌裝生產(chǎn)線的性能驗(yàn)證，染菌載體的制備以及生物安全柜滅菌效果的驗(yàn)證等。也可用于直接培養(yǎng)等。