懸浮培養(yǎng)指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的組織培養(yǎng)系統(tǒng)，下面一起來了解一下懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟與注意事項。

　　一、步驟

　　1. 將準(zhǔn)備好的凍存細(xì)胞放入37℃水浴中解凍。

　　2. 用70%乙醇對頂端進(jìn)行消毒，用吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5mlwan全MEM-10培養(yǎng)基的25cm2組織培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2加濕培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。

　　3. 將培養(yǎng)基吸出，用0.5ml37℃的胰yi酶/EDTA覆蓋細(xì)胞，消化30~40s。

　　4. 加入10ml旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中。室溫1800g離心5min，棄上清。

　　5. 將細(xì)胞沉淀懸浮在5ml的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5中，上下吹打，將細(xì)胞團(tuán)打散。

　　6. 在100ml或200ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶中加入50ml旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到瓶中。

　　7. 取出1ml細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5，使細(xì)胞密度為（3~4）×105細(xì)胞/ml。將細(xì)胞放入無CO2培養(yǎng)箱，37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

　　8. 隨后的兩天讓細(xì)胞繼續(xù)生長，并且每天對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5以維持（3~4）×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。

　　9. 取1ml的細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測。

　　10. 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到（4~5）×105細(xì)胞/ml時，隔天或每天用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5×105或2.5×105細(xì)胞/ml。

　　11. 分別將裝有50ml或100ml細(xì)胞懸液的100ml或200ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶放入37℃無CO2培養(yǎng)箱旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每天或隔天傳代。

　　二、注意事項

　　由于有些細(xì)胞是不能被養(yǎng)活的，所以需要高的初始密度。