原因：

1、引物特異性差

2、模板或引物濃度過高

3、酶量過多

4、Mg2+濃度偏高

5、退火溫度偏低

6、循環(huán)次數(shù)過多

提高擴(kuò)增效率和PCR的特異性方法

引物

引物設(shè)計(jì)：引物長度適當(dāng)，18-24mers，并保證序列獨(dú)du特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但長度大于24核苷的引物并不意味著有更高的特異性，較長的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對序列雜交，反而降低特異性，而且長序列比短序列雜交慢，影響產(chǎn)量； 引物濃度：引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。

Mg2+

較高的Mg2+濃度可以增加產(chǎn)量，但也會(huì)降低特異性。為了確定最佳濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行最適Mg2+濃度測定

退火溫度

Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。退火溫度一般設(shè)定為比引物的Tm低5℃的溫度。合理的退火溫度為55-70℃。在理想狀態(tài)下，退火溫度應(yīng)足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。

巢式PCR

使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增，由于同兩套引物都互補(bǔ)的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，從而提高PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度

遞減PCR

通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣，特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，并在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢

熱啟動(dòng)PCR

通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達(dá)到變性溫度。最chang用的是熱啟動(dòng)DNA 聚合酶，常溫時(shí)該酶活性被抑制，94-95℃加熱數(shù)分鐘后回復(fù)正常活力開始反應(yīng)，這樣可以避免起始循環(huán)溫度下的非特異性擴(kuò)增，大大提高了PCR反應(yīng)的靈敏度及特異性。熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一

PCR增強(qiáng)劑

包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等，能構(gòu)降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。